Toplum kökenli ve hastane kaynaklı enfeksiyonlardan sorumlu olan Pseudomonas aeruginosa’da artan antibiyotik direnci küresel önem taşımaktadır. Dışa atım pompalarının aktivite artışı, dış membran porin geçirgenliğinin azalması ve karbapenemaz üretimi P.aeruginosa’da direnç gelişiminde rol oynayan en önemli mekanizmalardır. Bu çalışmada, P.aeruginosa izolatlarında resistance nodulation division (RND) dışa atım pompalarının, outer membrane porin D (OprD) dış membran proteininin ve karbapenemaz üretiminin farklı antibiyotiklere karşı direnç gelişimindeki etkilerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmaya, 2019-2021 yılları arasında hastanemiz klinik örneklerinden izole edilmiş 80 P.aeruginosa izolatı dahil edilmiştir. İzolatların tür düzeyinde tanımlanması MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Almanya) ile yapılmıştır. Antibiyotik duyarlılıkları Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi [The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)] kriterlerine göre VITEK® 2 (bioMérieux, Fransa) sistemiyle belirlenmiştir. Dış membran porin proteini OprD ile dışa atım pompalarının düzenleyici genleri olan mexB, mexC, mexE ve mexX ekspresyon düzeyleri gerçek zamanlı kantitatif revers transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu [quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (Rt-qPCR)] ile araştırılmıştır. rpsL geni referans gen, P.aeruginosa PAO1 suşu kontrol suş olarak Rt-qPCR çalışmalarında kullanılmış ve karşılaştırmalı ekspresyon analizi delta-delta cycle threshold (ΔΔCt) yöntemiyle hesaplanmıştır. Çalışmada blaOXA-48, blaNDM, blaVIM, blaIMP, blaKPC ve blaOXA-10 varlığı PCR ile araştırılmıştır. İzolatlar arasındaki klonal ilişki M13 primeri kullanılarak AP-PCR ile belirlenmiştir. Bant profilleri GelCompar II (Applied Maths) yazılım sistemi kullanılarak analiz edilmiştir. İzolatlarının %63.7’sinde, karbapenem dirençli izolatların ise %74’ünde OprD ekspresyonunda azalma tespit edilmiştir. OprD için ekspresyon düzeyindeki azalma yalnızca karbapenem duyarlı (n= 30) ve karbapenem dirençli (n= 50) gruplar arasında anlamlı bulunmuştur (p= 0.014). mexB aşırı ekspresyon oranı karbapenem dirençli izolatlarda %82, karbapenem duyarlılarda %33; çok ilaca dirençli (ÇİD) izolatlarda %76.6, ÇİD olmayanlarda ise %45.5 olarak bulunmuştur (sırasıyla p= 0.001; p= 0.004). mexX aşırı ekspresyon oranı amikasine dirençli ve duyarlı grupta sırasıyla, %68 ve %40; gentamisine dirençli ve duyarlı grupta ise %64.3 ve %40.4 olarak bulunmuştur (sırasıyla, p= 0.02; p= 0.041). Çok ilaca dirençli izolatların %61.7’si, ÇİD olmayanların ise %30.3’ünde mexX aşırı ekpresyonu bulunmuştur (p= 0.006). mexC ve mexE ekspresyonu için antibiyotiklere duyarlı ve dirençli gruplar arasında anlamlı fark saptanmamıştır. Karbapenem dirençli izolatların %32 (16/50)’sinde blaOXA-10 saptanırken, hiçbir izolatta blaOXA-48, blaNDM, blaVIM, blaIMP, blaKPC varlığı saptanmamıştır. AP-PCR analizinde, 64 farklı genotip saptanmış ve baskın bir genotip izlenmemiştir. İzolatların 14 farklı küme içinde gruplandığı ve kümeleşme oranının %36 olduğu bulunmuştur. P.aeruginosa’da özellikle RND dışa atım sistemlerinin antibiyotik direnç gelişiminde önemli rolü bulunmaktadır. Bu çalışma, mexB aşırı ekspresyonu ve OprD ekspresyonunda azalmanın karbapenem direnci gelişiminde; mexX aşırı ekspresyonunun ise amikasin ve gentamisine direnç gelişiminde rolü olduğunu göstermiştir. mexB ve mexX aşırı ekspresyonunun ÇİD izolatlar ile anlamlı düzeyde ilişkili olduğu bulunmuştur. İzolatların 16’sında blaOXA-10 varlığı saptanmış ve bu direnç geni varlığının karbapenem direnç gelişiminde katkısı olabileceği değerlendirilmiştir.
The increasing antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa, responsible for both community-ac- quired and hospital-acquired infections, is of global significance. The primary mechanisms contribut- ing to resistance development in P.aeruginosa include the increased activity of efflux pumps, decreased permeability of outer membrane porins and the production of carbapenemases. This study aimed to determine the effects of resistance nodulation division (RND) efflux pumps, outer membrane porin D (OprD) outer membrane protein and carbapenemase production on the development of resistance to different antibiotics in P.aeruginosa isolates. Eighty P.aeruginosa isolates obtained from clinical samples in our hospital between 2019 and 2021 were included in the study. Species-level identification of the iso- lates was performed using MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Germany). Antibiotic susceptibilities were determined using the VITEK® 2 (bioMérieux, France) system according to the criteria of the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). The expression levels of the outer mem- brane porin protein OprD and the regulatory genes of efflux pumps (mexB, mexC, mexE, and mexX) were investigated using real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (Rt-qPCR). The rpsL gene was used as the reference gene and P.aeruginosa PAO1 strain was used as the control strain in Rt-qPCR. Comparative expression analysis was calculated using the delta-delta cycle threshold (ΔΔCt) method. The presence of blaOXA-48, blaNDM, blaVIM, blaIMP, blaKPC and blaOXA-10 was investigated by PCR. Clonal relationships among the isolates were determined by AP-PCR using the M13 primer. Band profiles were analyzed using GelCompar II (Applied Maths) software. Decreased OprD expression was detected in 63.7% of the isolates and 74% of carbapenem-resistant isolates. The decrease in OprD expression was found to be significant only between the carbapenem-susceptible (n= 30) and carbapenem-resistant (n= 50) groups (p= 0.014). The overexpression rate of mexB was 82% in carbapenem-resistant isolates and 33% in carbapenem-susceptible isolates; 76.6% in multidrug-resistant (MDR) isolates and 45.5% in non-MDR isolates (p= 0.001 and p= 0.004, respectively). The overexpression rate of mexX was 68% and 40% in the amikacin-resistant and susceptible groups, respectively; and 64.3% and 40.4% in the gentamicin-resistant and susceptible groups, respectively (p= 0.02 and p= 0.041, respectively). Over- expression of mexX was found in 61.7% of MDR isolates and 30.3% of non-MDR isolates (p= 0.006). No significant difference was found in the expression of mexC and mexE between antibiotic-susceptible and resistant groups. While blaOXA-10 was detected in 32% (16/50) of carbapenem-resistant isolates, blaOXA-48, blaNDM, blaVIM, blaIMP, blaKPC were not detected in any of the isolates. AP-PCR analysis identified 64 different genotypes and no dominant genotype was observed. The isolates were grouped into 14 different clusters with a clustering rate of 36%. RND efflux systems play a crucial role in the development of antibiotic resistance in P.aeruginosa. This study showed that overexpression of mexB and decreased expression of OprD contributed to the development of carbapenem resistance, while overexpression of mexX contributed to the development of amikacin and gentamicin resistance. Overexpression of mexB and mexX has significant correlation with MDR isolates. The detection of blaOXA-10 in 16 isolates suggests that the presence of this resistance gene may contribute to the development of carbapenem resistance
