Proje Özeti

Metabolik hastalıkların tedavisinde birçok enzim, ilaç olarak kullanılmaktadır. Enzim-ilaçların ortak özelliği substratlarının insan dolaşım sisteminde bulunmaları ve enzim ilaçların bu substratları süpürerek o hastalığın tedavisine imkân sağlamalarıdır. Bu tip enzim-ilaçların katalitik etkinliği ve in vivo yarı ömrü tedavinin başarısını önemli bir şekilde etkilemektedir. Ancak, bu enzim ilaçların çoğu biyoteknolojik ürün olduğu için hem üretim prosesi pahalıdır hem de yüksek dozda kullanıldıklarından dolayı hastalarda ciddi yan etkilere neden olmaktadır. Bundan dolayı bu klinik enzimlerin hem yan etkilerini sınırlamak hem de in vivo yarı ömrünü arttırmada kullanılan tek yol immobilizasyondur. Ancak, immobilizasyon işleminin handikapı ise enzimin katalitik etkinliğini azaltmasıdır. Bu yüzden immobilize enzim ilaçların katalitik etkinliğini arttırmak için yenilikçi yaklaşımlara kesinlikle ihtiyaç vardır. Bu bağlamda literatürde UV ışık veya manyetik alan indüklü enzim platformları bulunmaktadır. Bununla beraber literatürde UV ışığı için toksisite ve iç dokulara ulaşımının kısıtlı olması ve manyetik alan için ise toksisite gibi kaygılar mevcuttur. NIR uyarımı ise düşük toksisite ve iç dokulara ulaşabilirliği ile bu alanda önemli bir alternatif olabilir.  Ayrıca NIR tıp alanında görüntüleme, kontrollü ilaç salınımı ve fotodinamik terapi gibi farklı uygulamalar için yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Ancak, enzim ilaçların katalitik etkinliğini arttırmak için daha önce denenmemiştir. Uygun dalga boyundaki NIR ışığına maruz bırakılan upconverting nanopartiküllere (UCNP) bağlı bulunan enzimin ve aktif merkezinde bulunan bağların titreşimiyle kendi substratı ile daha uygun konformasyonda birleşeceği, reaksiyon sonrası ürünlerin daha hızlı olarak aktif merkezden ayrılacağı ve bu sayede enzimin katalitik etkinliğinin Förster Rezonans Enerji Transfer (FRET) mekanizmasına göre artacağını hipotezlemekteyiz. Buna ilaveten NIR ışığının uygulandığı bölgedeki sağlıklı hücrelere zarar vermeyecek derecede ısı yayması nedeniyle ilaç uygulamalarında rahatlıkla hastaya uygulanabilecektir.

Bu enzim ilaçların en önemli örneklerinden biri L-asparajinaz (L-ASNaz) olup pegile L-ASNaz (PEG-LASNaz) formunda klinikte Akut Lenfoblastik Lösemi (ALL) hastalığının birinci aşaması olan remisyon (iyileşmenin görüldüğü safha) tedavisinde kullanılan vazgeçilmez bir ilaçtır. Önerdiğimiz proje sayesinde ilk kez klinikte kullanılan en önemli enzim ilaçlardan biri olan L-ASNaz için suda iyi dağılan ve biyouyumlu yapıda fonksiyonel uç gruba sahip UCNP’lerin hazırlanması, PEG-L-ASNaz enziminin immobilizasyonu, NIR etkisi ile aktivitesinin tetiklenerek arttırılması ve mekanizmasına yönelik çalışmalar gerçekleştirilecektir. Ayrıca optimum özelliklerde hazırlanan immobilize sistemin in vitro ve in vivo modellerdeki etkinlikleri belirlenecektir.

Projemiz kapsamında öncelikle NaYF₄, Yb³⁺, Er³⁺, Nd³⁺ (800 nm’de uyarılan) ve NaYF₄, Yb³⁺, Er³⁺ (veya Tm³⁺) (980 nm’de uyarılan) UCNP’ler hidrotermal yöntemle sentezlenecek ve yüzey morfolojisi TEM ile, kristalitesi toz XRD ile,  fonksiyonel grupları FTIR ile, termal özellikler TGA ve DSC ile, fotofiziksel özellikleri Floresans spektrometresi ile karakterize edilecektir. Yüzeyleri polietilenimin (PEI), 3-izosiyanatopropiltrietoksisilan (ICPTES) ve epoksi (3-glisidiloksipropil)trimetoksisilan (GPTMS) bileşikleri ile modifiye edilmiş  optimum özelliklere (parçacık boyutu, yüzey alanı, ışıma özellikleri vb.) sahip nanopartiküllere L-ASNaz enziminin immobilizasyonu, fiziksel (elektrostatik) ve/veya kimyasal (kovalent) yöntemlerle gerçekleştirilecektir. Daha sonra, enzim içeren taşıyıcı platformlar için NIR tetikleme parametreleri olarak lazer şiddeti ve uygulama süresi çalışmaları gerçekleştirilecektir. Uygun özellikteki taşıyıcı platformlar için immobilizasyon parametreleri (immobilizasyon verimi, optimum pH, sıcaklık, termal kararlılık, yeniden kullanılabilirlik, in vitro yarı ömür, depolama kararlılığı, tripsin direnci vb.) detaylı bir şekilde araştırılacak ve serbest enzimlerle kıyaslanacaktır. NIR tetikleme mekanizmasının ortaya konması amacıyla UCNP-PEG-L-ASNaz’lar için adsorbsiyon ve difüzyon modelleri araştırılacaktır. UCNP ve UCNP-PEG-L-ASNaz’lar için in vitro toksisite çalışmaları L929 fare fibroblast hücre hattında gerçekleştirilecektir. UCNP ve UCNP-PEG-L-ASNaz’ların biyolojik mimik sıvılarda kararlılık, plazma koagülasyonu ve hemoliz testleri yapılacaktır. Ayrıca elde edilecek optimum özellikteki UCNP-PEG-L-ASNaz için akut lösemik hücre hattı (HL60) NIR uyarımını içerecek şekilde etkinlik çalışmaları gerçekleştirilecektir. Projemizin son aşamasında ise, hazırlanan bu yapılar rat hayvan model sistemine uygulanarak in vivo sistemde katalitik etkinlik, biyouyumluluk ve biyodağılım çalışmaları gerçekleştirilecektir.

Sonuç olarak, bu proje çalışmaları sonucunda öncelikle PEG-L-ASNaz enzim-ilacı için yeni bir taşıyıcı platform dizayn edilecek ve proje çıktıları sayesinde etki değeri yüksek dergilerle literatüre yenilik kazandırılacaktır. Bunun yanı sıra, hâlihazırda bu enzim-ilacı metabolik hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Uygun NIR yönlendirilmesi ile bu enzimin katalitik etkinliği arttırılabilir ve bu sayede enzim-ilaçlardan maksimum düzeyde biyoyararlanım sağlanabilir. Ayrıca yapılacak bu metadoloji çalışmasında başarılı sonuçlar elde edilmesi hâlihazırda kullanılan diğer enzim-ilaçlar için benzer yaklaşımların oluşturulması yönünde birçok projenin yapılmasına yol açabilir.